Millipore的Amicon®Ultra超濾管的使用方法
更新時間：2023-11-15 瀏覽次數：2773
默克 Millipore Amicon® Ultra 離心式超濾管因其wan美的設計一經推出即成為(wei) 生物樣品操作的產(chan) 品。不論是蛋白、核酸、病毒或顆粒物，抑或低濃度樣品或寶貴的活性樣品，Amicon® Ultra 都能兼顧高回收率和操作的方便性及標準化，並滿足下遊各種應用的要求，使研究者處理樣品時倍感輕鬆。但是，在默克生命科學團隊推出超濾管中文說明書(shu) (AU0.5/4/15)之前，我們(men) 發現近90%的使用者在選擇和使用過程中因為(wei) 缺乏必要信息而沒有獲得最佳體(ti) 驗，更重要的是，寶貴的樣本會(hui) 遭受本可避免的損失！
選對截留分子量，事半功倍
如果目的蛋白是120kDa，請問應該選擇的超濾管規格是100k，50k，還是30k甚至10k？你采用的是1/2，1/3抑或1/6算法？這些沒有統一的說法，是因為(wei) 不同廠家的膜的截留分子量的定義(yi) 不同。Millipore的超濾管采用其有的再生纖維素膜，定義(yi) 為(wei) ：一個(ge) 確定NMWL 的超濾膜應該截留至少90% 以上的這個(ge) 大小的球形分子，即100kDa的球形蛋白用100k的Ultracel®再生纖維素膜得率超過90%。請仔細查看以下默克生命科學數據：
(以0.5mL的AU0.5為(wei) 例，其它型號截留分子量的選擇原則一致，具體(ti) 離心力和離心時間不同。)
截留分子量選小啦！看到這個(ge) 表，你是否發現原來抱怨Millipore超濾管流速偏慢的根源來自對於(yu) Millipore截留分子量定義(yi) 的誤解。膜孔徑要小於(yu) 目的分子這是第一原則。如果分子有近似球形的立體(ti) 結構(而非明顯的線性分子)，在Millipore再生纖維素超濾膜體(ti) 係內(nei) ，選擇“等於(yu) "或“略小於(yu) "目的分子的截留分子量的超濾管是zui選擇，這樣操作起來又快又好，既保證了樣品回收率，又縮短了離心時間，大幅降低大分子損傷(shang) 風險。
Amicon® Ultra係列超濾管產(chan) 品需要根據起始樣品體(ti) 積、目標蛋白或核酸的分子量、終體(ti) 積及濃縮倍數等選擇具體(ti) 型號。下表為(wei) 選擇適合截留分子量的超濾管提供了一些參考建議。
收取體(ti) 積已經很小的濃縮好的樣品時，你會(hui) ：
A 購買(mai) 最尖細的槍頭，把樣品吸回來
B 濃縮倍數低一點，以便用槍頭把樣品吸回來
C 反轉離心回收，獲得最高得率
正確答案“C",你答對了麽(me) ？
Millipore的Amicon® Ultra係列超濾管上樣體(ti) 積有0.5/2/4/15/70mL等五種，除了采用低吸附的管材和低蛋白吸附的再生纖維素超濾膜，其中0.5mL，2mL和70mL的規格還特別設計了反轉回收模式，以便使已經濃縮的樣品回收。
現在你總該知道為(wei) 什麽(me) 收到AU0.5的時候會(hui) 有兩(liang) 個(ge) 外管了吧～
更多關(guan) 於(yu) 超濾管的正確使用問題：
蛋白在濃縮時出現了沉澱，如何改進？
蛋白如果濃縮過快或者過度濃縮都有可能引起蛋白沉澱。建議蛋白濃縮後的最終濃度不超過20mg/ml。對於(yu) 對濃縮速度敏感而容易沉澱的蛋白，建議的改進方法是：
1）離心力降為(wei) 推薦離心力的30%-50%
2）改用截留分子量更大的超濾管（如原本選用10k，此時可以選擇30k）
3）在濃縮過程中取出超濾管，用槍頭反複吹吸幾次後再繼續濃縮
4）體(ti) 積較大的樣品可考慮選用攪拌式超濾杯，減少沉澱的發生。
Amicon® Ultra超濾管可以用酒精消毒滅菌麽(me) ？
Amicon® Ultra與(yu) 70%乙醇是兼容的，但是對滅菌處理的具體(ti) 方法沒有做相關(guan) 的測試，所以無法提供更進一步的參考信息。建議采用Ultrafree無菌離心管對濃縮後的樣品進行過濾除菌。
Amicon® Ultra超濾裝置是否可以用於(yu) 高壓滅菌？
Amicon® Ultra都是采用熱封設計，不可以用高壓高溫滅菌。
懷疑濃縮過程中目的蛋白和超濾膜之間可能存在非特異性吸附，如何改善？
Amicon® Ultra超濾管使用的是再生纖維素膜，這種材質是蛋白吸附的超濾膜。但是對於(yu) 一些疏水性蛋白或非極性蛋白，它們(men) 和膜的非特異吸附可能會(hui) 增強。對於(yu) 這種情況，可以嚐試在實驗前對超濾管進行封閉處理，也可以嚐試換成Amicon® Ultra 0.5或2來進行實驗，通過減小膜麵積來降低非特異性吸附。
有時候用超濾離心管連水都離不下來，可能是什麽(me) 原因？
Amicon® Ultra超濾膜中含有微量甘油。如果出現這種情況，請先用0.1 N NaOH清洗再離心。最後用緩衝(chong) 液或Milli-Q®水再次清洗後甩幹。清洗後的濾膜應立即使用，如暫時不用，請保持潤濕狀態，避免重新幹燥。
如果要用超濾的方法分離兩(liang) 種蛋白，那麽(me) 這兩(liang) 個(ge) 蛋白的大小需要相差多少？
按照經驗，建議兩(liang) 個(ge) 蛋白的分子量要相差一個(ge) 數量級（10倍）。
說明書(shu) 中推薦在室溫下進行離心，考慮到蛋白的穩定性，是否可以在4℃進行離心？
可以，但是低溫會(hui) 增加蛋白樣品的粘性，導致流速減慢，建議可將離心時間延長到原來的1.5倍。
濃縮後發現濃縮液中沒有目的蛋白，可能的原因有哪些？
首先，Amicon® Ultra超濾管的蛋白zui低起始濃度為(wei) 25ug/ml。請確保樣本的起始濃度大於(yu) 這個(ge) 濃度。其次，如果問題仍然出現，請不要丟(diu) 棄樣本濾過液以便用於(yu) 分析可能的原因：
1）如果目的樣本在濾過液中，那麽(me) 請排查：
a） 是否選擇了合適截留分子量的超濾管（目的蛋白分子量的1/2或者1/3）？
b）使用的離心力是否是在限定範圍內(nei) ？如果使用的是rpm，請換算成相應的g離心力，具體(ti) 換算方法請垂詢。
c）離心機最近是否有校準過？
d）是否嚐試這個(ge) 蛋白？如果能確保用同樣的超濾管對其它蛋白成功操作的話，那麽(me) 有可能是這個(ge) 目的蛋白的原因。有時蛋白會(hui) 因其本身的一些特性（構象差異）而影響濃縮效果，建議選用更小截留分子量的超濾管（如原本選用30k，此時可以選擇10k）
2）如果目的樣本也不在濾過液中，那麽(me) ：
a）蛋白樣本起始濃度是否大於(yu) 25ug/mL？
b）用來確定樣本濃度的方法是什麽(me) ？是否可信？
c）目的蛋白是不是沉澱了？如果是，具體(ti) 解決(jue) 方法請參考上麵的關(guan) 於(yu) 蛋白沉澱問題的解釋。
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